近日,上海交通大學(xué)王鵬飛教授和團(tuán)隊(duì),設(shè)計(jì)一種無(wú)需預(yù)擴(kuò)增的新型 DNAzyme 傳感器,并將其并命名為 SPOT。
圖 | 王鵬飛(來(lái)源:王鵬飛)
對(duì)于以 miRNA 和病毒 RNA 為代表的多種臨床意義核酸標(biāo)記物,本次傳感器均具備檢測(cè)能力,并能實(shí)現(xiàn)快速、便捷的臨床分子診斷應(yīng)用。
通過(guò)針對(duì)血清 miRNA 進(jìn)行敏感和特異的檢測(cè),進(jìn)而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多種癌癥的分子診斷。
此外,SPOT 能從臨床拭子中靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè) SARS-CoV-2 RNA。同時(shí),SPOT 可以與側(cè)流層析技術(shù)聯(lián)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)于核酸靶標(biāo)的即時(shí)(POCT,point-of-care testing)檢測(cè)。
(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)
鑒于 SPOT 完全由合成 DNA 分子構(gòu)建,避免了對(duì)于昂貴蛋白質(zhì)酶的需求,具備較好的成本優(yōu)勢(shì)。
實(shí)驗(yàn)顯示,一次 SPOT 測(cè)定的材料成本,大約低至 0.02 美元,明顯低于已有的檢測(cè)體系。
與現(xiàn)有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶標(biāo)測(cè)定相比,這種靈敏且特異的分析性能、一步法的操作方案、低成本的優(yōu)勢(shì)、以及和 POCT 能力的結(jié)合,讓 SPOT 能夠成為一種更好的測(cè)定方法。
未來(lái)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,該團(tuán)隊(duì)希望利用 SPOT 體系針對(duì)循環(huán)體內(nèi)核酸進(jìn)行檢測(cè),實(shí)現(xiàn)多類型疾病的靈敏特異分子診斷,從而為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供新的可能。
進(jìn)一步地,他們也希望基于核酸適體的結(jié)合,能夠進(jìn)行小分子與蛋白的檢測(cè),擴(kuò)展 SPOT 系統(tǒng)在多方面的臨床診斷應(yīng)用。
此前,在體內(nèi)遞送治療方面,傳統(tǒng)的 DNAzyme 不具備可編程的靶向性。而該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的新型 DNAzyme 體系可以快速設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)可編程的靶向目標(biāo)鏈,并通過(guò)切割來(lái)達(dá)到治療目標(biāo)。
總的來(lái)說(shuō),這一創(chuàng)新有望為疾病治療提供更精準(zhǔn)、更有效的手段,為基因治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來(lái)重要推動(dòng)。
(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)
那么,本次成果的研發(fā)必要性是什么?它彌補(bǔ)了已有測(cè)量工具的哪些不足?
據(jù)介紹,生物體液(血液、尿液、汗液等)中存在的核酸分子,是對(duì)包括癌癥和病毒感染等重大疾病進(jìn)行分子診斷的一類關(guān)鍵生物標(biāo)志物。
然而,核酸標(biāo)志物存在低豐度、高度動(dòng)態(tài)、高異質(zhì)性、背景干擾大等特點(diǎn),其臨床檢測(cè)面臨著測(cè)不出、測(cè)不準(zhǔn)、測(cè)不全、測(cè)不了、測(cè)不起等挑戰(zhàn)。
因此,迫切需要開(kāi)發(fā)超靈敏、高特異、通量高、便捷經(jīng)濟(jì)的核酸生物標(biāo)志物檢測(cè)分析方法。
DNAzymes 是一類體外篩選的合成 DNA 分子,具有類似酶的催化活性,例如裂解核酸磷酸二酯鍵。
典型的裂解核酸 DNAzyme,由具有催化能力的催化核心、以及用于通過(guò)序列互補(bǔ)性識(shí)別底物的兩條臂組成。
因此,當(dāng)前許多 DNAzyme 已經(jīng)廣泛用于體外和體內(nèi)的金屬離子檢測(cè),因?yàn)樗鼈兊拇呋钚愿叨纫蕾囉诮饘匐x子。
然而,具有小分子、蛋白質(zhì)或核酸檢測(cè)能力的 DNAzyme 鮮有報(bào)道,導(dǎo)致這些目標(biāo)很難被檢測(cè)到。
受自然酶和核酸酶的啟發(fā),通過(guò)實(shí)施異構(gòu)模塊(如 aptamer、toehold)來(lái)設(shè)計(jì)異構(gòu)的 DNAzyme 生物傳感器,可以通過(guò)小分子、蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)菌等,調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)其催化活性。
傳統(tǒng)的異構(gòu) DNAzyme 生物傳感器通常被設(shè)計(jì)成多組分分子復(fù)合體,通過(guò)具有 toehold 的抑制鏈,來(lái)抑制并釋放 DNAzyme。
以及通過(guò)在靶結(jié)合后分裂并恢復(fù)催化核心,或通過(guò)靶誘導(dǎo)的 DNAzyme-底物-靶標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于核酸靶的直接檢測(cè)。
然而,這些生物傳感系統(tǒng)對(duì)于定向核酸的直接檢測(cè),通常表現(xiàn)出皮摩爾至納摩爾的敏感性,因此無(wú)法探測(cè)臨床樣本中的 miRNA 或病毒 RNA 標(biāo)志物。
而許多 miRNA 被視為是多種癌癥的潛在生物標(biāo)志物,然而由于缺乏癌癥診斷的敏感性和特異性,很少有 miRNA 被證明在臨床上有用。
王鵬飛認(rèn)為,這種多組分設(shè)計(jì)可能會(huì)對(duì)其檢測(cè)能力產(chǎn)生負(fù)面影響。
由于一些原因比如化學(xué)計(jì)量的不完善、動(dòng)力學(xué)分子陷阱、催化活性受損、以及信號(hào)泄漏的風(fēng)險(xiǎn)增加,會(huì)導(dǎo)致低豐度目標(biāo)更加難以被測(cè)量。
而該課題組的主要研究興趣是:開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷、靈敏的新型疾病分子診斷方法。
通過(guò)調(diào)研,該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)體液中的循環(huán)核酸已經(jīng)成為多種疾病的重要液體活檢生物標(biāo)志物。
由于這些核酸生物標(biāo)志物在生物標(biāo)本中的高度動(dòng)態(tài)、異質(zhì)性和低豐度,導(dǎo)致其臨床檢測(cè)面臨著巨大挑戰(zhàn)。
傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,Polymerase Chain Reaction)技術(shù)需要嚴(yán)格的樣品處理、昂貴儀器和專業(yè)操作。
而新型等溫?cái)U(kuò)增方法,比如重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)等則能簡(jiǎn)化操作過(guò)程。
而盡管 CRISPR 結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),能夠顯示出較高的靈敏度和便捷性,但是存在非特異性擴(kuò)增、連續(xù)操作步驟和對(duì)昂貴易損酶的需求等缺陷,限制了臨床上的應(yīng)用。
通過(guò)對(duì)以上這些因素的思考、并結(jié)合課題組自身優(yōu)勢(shì),他們定下了本次課題。
(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)
通過(guò)理論模擬與設(shè)計(jì),他們?cè)O(shè)計(jì)出了這種新型 DNAzyme 傳感器 SPOT。為了明確 SPOT 的機(jī)制并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù),課題組研究了具體的激活方式、以及可應(yīng)用的核酸靶標(biāo)長(zhǎng)度。
由于 DNAzyme 傳感器的自身特性,最初他們?cè)O(shè)計(jì)的 DNAzyme 傳感器信號(hào)泄漏非常嚴(yán)重,無(wú)論如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,都無(wú)法達(dá)到穩(wěn)定、高靈敏的檢測(cè)目的。
通過(guò)大量的文獻(xiàn)調(diào)研,以及學(xué)習(xí)和理解此前 DNAzyme 傳感器的設(shè)計(jì)原理,再結(jié)合組內(nèi)討論他們認(rèn)為:自封鎖核酸鏈的設(shè)計(jì),或許可以解決信號(hào)泄漏的問(wèn)題。
后來(lái),通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn),信號(hào)泄漏問(wèn)題已經(jīng)被解決。但是,DNA 酶?jìng)鞲衅鲄s無(wú)法被激活。
于是,他們進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù),通過(guò)縮短結(jié)合臂的長(zhǎng)度,最后成功構(gòu)建了 DNAzyme 傳感器。
通過(guò)此,他們構(gòu)造了一個(gè)單鏈、自鎖定的單分子系統(tǒng),并將這種傳感系統(tǒng)命名為 SPOT(用于核酸檢測(cè)的靈敏的環(huán)啟動(dòng) DNAzyme 生物傳感器)。
同時(shí),他們進(jìn)一步將 SPOT 與試紙條結(jié)合,為 SPOT 實(shí)現(xiàn) POCT 檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
經(jīng)過(guò)全面優(yōu)化和 SPOT 檢測(cè),在單管、一步、無(wú)預(yù)擴(kuò)增和等溫檢測(cè)的前提下,實(shí)現(xiàn)了對(duì) miR-21 的 15fM、對(duì)病毒 RNA 的 1.9aM 的強(qiáng)大檢測(cè)靈敏度,以及對(duì)于核酸靶標(biāo)的檢測(cè)特異性(區(qū)分變異體)。
最終,相關(guān)論文以《一種用于核酸敏感檢測(cè)的可編程 DNAzyme》(A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids)為題發(fā)在 Angewandte Chemie International Edition[1]。
史辰致是第一作者,王鵬飛擔(dān)任通訊作者。
圖 | 相關(guān)論文(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)
不過(guò),目前只有少量臨床樣本在 SPOT 上進(jìn)行測(cè)試。未來(lái),課題組將對(duì)更多患者進(jìn)行臨床研究,以便全面評(píng)估 SPOT 測(cè)定的可靠性。
同時(shí),由于本次研究采用了無(wú)前置放大器的方案,因此 SPOT 還不夠靈敏,無(wú)法在肉眼可見(jiàn)的測(cè)試條上,產(chǎn)生明顯可區(qū)分的讀數(shù)。
因此,該團(tuán)隊(duì)打算進(jìn)一步提高 SPOT 的靈敏度,或與基于等離子體/熒光的便攜式可視化設(shè)備結(jié)合,以便讓 SPOT 的 POCT 能力能被用于實(shí)際應(yīng)用。
未來(lái),在臨床應(yīng)用層面,他們希望能夠建立多中心、大規(guī)模臨床隊(duì)列,對(duì) SPOT 體系的疾病診斷效能進(jìn)行更大范圍的論證。
在技術(shù)改進(jìn)層面,該團(tuán)隊(duì)計(jì)劃拓展 SPOT 的應(yīng)用范圍。除了核酸檢測(cè)外,他們也希望通過(guò)引入核酸適體,來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于小分子和蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。
參考資料:
1.Shi, C., Yang, D., Ma, X., Pan, L., Shao, Y., Arya, G., … & Wang, P. (2024). A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids. Angewandte Chemie International Edition, e202320179.
運(yùn)營(yíng)/排版:何晨龍
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