近日，上海交通大學(xué)王鵬飛教授和團(tuán)隊(duì)，設(shè)計(jì)一種無(wú)需預(yù)擴(kuò)增的新型 DNAzyme 傳感器，并將其并命名為 SPOT。

圖 | 王鵬飛（來(lái)源：王鵬飛）

對(duì)于以 miRNA 和病毒 RNA 為代表的多種臨床意義核酸標(biāo)記物，本次傳感器均具備檢測(cè)能力，并能實(shí)現(xiàn)快速、便捷的臨床分子診斷應(yīng)用。

通過(guò)針對(duì)血清 miRNA 進(jìn)行敏感和特異的檢測(cè)，進(jìn)而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多種癌癥的分子診斷。

此外，SPOT 能從臨床拭子中靈敏準(zhǔn)確地檢測(cè) SARS-CoV-2 RNA。同時(shí)，SPOT 可以與側(cè)流層析技術(shù)聯(lián)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)于核酸靶標(biāo)的即時(shí)（POCT，point-of-care testing）檢測(cè)。

（來(lái)源：Angewandte Chemie International Edition）

鑒于 SPOT 完全由合成 DNA 分子構(gòu)建，避免了對(duì)于昂貴蛋白質(zhì)酶的需求，具備較好的成本優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)顯示，一次 SPOT 測(cè)定的材料成本，大約低至 0.02 美元，明顯低于已有的檢測(cè)體系。

與現(xiàn)有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶標(biāo)測(cè)定相比，這種靈敏且特異的分析性能、一步法的操作方案、低成本的優(yōu)勢(shì)、以及和 POCT 能力的結(jié)合，讓 SPOT 能夠成為一種更好的測(cè)定方法。

未來(lái)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，該團(tuán)隊(duì)希望利用 SPOT 體系針對(duì)循環(huán)體內(nèi)核酸進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)多類型疾病的靈敏特異分子診斷，從而為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供新的可能。

進(jìn)一步地，他們也希望基于核酸適體的結(jié)合，能夠進(jìn)行小分子與蛋白的檢測(cè)，擴(kuò)展 SPOT 系統(tǒng)在多方面的臨床診斷應(yīng)用。

此前，在體內(nèi)遞送治療方面，傳統(tǒng)的 DNAzyme 不具備可編程的靶向性。而該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的新型 DNAzyme 體系可以快速設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)可編程的靶向目標(biāo)鏈，并通過(guò)切割來(lái)達(dá)到治療目標(biāo)。

總的來(lái)說(shuō)，這一創(chuàng)新有望為疾病治療提供更精準(zhǔn)、更有效的手段，為基因治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來(lái)重要推動(dòng)。

（來(lái)源：Angewandte Chemie International Edition）

那么，本次成果的研發(fā)必要性是什么？它彌補(bǔ)了已有測(cè)量工具的哪些不足？

據(jù)介紹，生物體液（血液、尿液、汗液等）中存在的核酸分子，是對(duì)包括癌癥和病毒感染等重大疾病進(jìn)行分子診斷的一類關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

然而，核酸標(biāo)志物存在低豐度、高度動(dòng)態(tài)、高異質(zhì)性、背景干擾大等特點(diǎn)，其臨床檢測(cè)面臨著測(cè)不出、測(cè)不準(zhǔn)、測(cè)不全、測(cè)不了、測(cè)不起等挑戰(zhàn)。

因此，迫切需要開(kāi)發(fā)超靈敏、高特異、通量高、便捷經(jīng)濟(jì)的核酸生物標(biāo)志物檢測(cè)分析方法。

DNAzymes 是一類體外篩選的合成 DNA 分子，具有類似酶的催化活性，例如裂解核酸磷酸二酯鍵。

典型的裂解核酸 DNAzyme，由具有催化能力的催化核心、以及用于通過(guò)序列互補(bǔ)性識(shí)別底物的兩條臂組成。

因此，當(dāng)前許多 DNAzyme 已經(jīng)廣泛用于體外和體內(nèi)的金屬離子檢測(cè)，因?yàn)樗鼈兊拇呋钚愿叨纫蕾囉诮饘匐x子。

然而，具有小分子、蛋白質(zhì)或核酸檢測(cè)能力的 DNAzyme 鮮有報(bào)道，導(dǎo)致這些目標(biāo)很難被檢測(cè)到。

受自然酶和核酸酶的啟發(fā)，通過(guò)實(shí)施異構(gòu)模塊（如 aptamer、toehold）來(lái)設(shè)計(jì)異構(gòu)的 DNAzyme 生物傳感器，可以通過(guò)小分子、蛋白質(zhì)、核酸或細(xì)菌等，調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)其催化活性。

傳統(tǒng)的異構(gòu) DNAzyme 生物傳感器通常被設(shè)計(jì)成多組分分子復(fù)合體，通過(guò)具有 toehold 的抑制鏈，來(lái)抑制并釋放 DNAzyme。

以及通過(guò)在靶結(jié)合后分裂并恢復(fù)催化核心，或通過(guò)靶誘導(dǎo)的 DNAzyme-底物-靶標(biāo)復(fù)合物的穩(wěn)定，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于核酸靶的直接檢測(cè)。

然而，這些生物傳感系統(tǒng)對(duì)于定向核酸的直接檢測(cè)，通常表現(xiàn)出皮摩爾至納摩爾的敏感性，因此無(wú)法探測(cè)臨床樣本中的 miRNA 或病毒 RNA 標(biāo)志物。

而許多 miRNA 被視為是多種癌癥的潛在生物標(biāo)志物，然而由于缺乏癌癥診斷的敏感性和特異性，很少有 miRNA 被證明在臨床上有用。

王鵬飛認(rèn)為，這種多組分設(shè)計(jì)可能會(huì)對(duì)其檢測(cè)能力產(chǎn)生負(fù)面影響。

由于一些原因比如化學(xué)計(jì)量的不完善、動(dòng)力學(xué)分子陷阱、催化活性受損、以及信號(hào)泄漏的風(fēng)險(xiǎn)增加，會(huì)導(dǎo)致低豐度目標(biāo)更加難以被測(cè)量。

而該課題組的主要研究興趣是：開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷、靈敏的新型疾病分子診斷方法。

通過(guò)調(diào)研，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)體液中的循環(huán)核酸已經(jīng)成為多種疾病的重要液體活檢生物標(biāo)志物。

由于這些核酸生物標(biāo)志物在生物標(biāo)本中的高度動(dòng)態(tài)、異質(zhì)性和低豐度，導(dǎo)致其臨床檢測(cè)面臨著巨大挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR，Polymerase Chain Reaction）技術(shù)需要嚴(yán)格的樣品處理、昂貴儀器和專業(yè)操作。

而新型等溫?cái)U(kuò)增方法，比如重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP，Loop-mediated isothermal amplification）等則能簡(jiǎn)化操作過(guò)程。

而盡管 CRISPR 結(jié)合等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，能夠顯示出較高的靈敏度和便捷性，但是存在非特異性擴(kuò)增、連續(xù)操作步驟和對(duì)昂貴易損酶的需求等缺陷，限制了臨床上的應(yīng)用。

通過(guò)對(duì)以上這些因素的思考、并結(jié)合課題組自身優(yōu)勢(shì)，他們定下了本次課題。

（來(lái)源：Angewandte Chemie International Edition）

通過(guò)理論模擬與設(shè)計(jì)，他們?cè)O(shè)計(jì)出了這種新型 DNAzyme 傳感器 SPOT。為了明確 SPOT 的機(jī)制并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，課題組研究了具體的激活方式、以及可應(yīng)用的核酸靶標(biāo)長(zhǎng)度。

由于 DNAzyme 傳感器的自身特性，最初他們?cè)O(shè)計(jì)的 DNAzyme 傳感器信號(hào)泄漏非常嚴(yán)重，無(wú)論如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，都無(wú)法達(dá)到穩(wěn)定、高靈敏的檢測(cè)目的。

通過(guò)大量的文獻(xiàn)調(diào)研，以及學(xué)習(xí)和理解此前 DNAzyme 傳感器的設(shè)計(jì)原理，再結(jié)合組內(nèi)討論他們認(rèn)為：自封鎖核酸鏈的設(shè)計(jì)，或許可以解決信號(hào)泄漏的問(wèn)題。

后來(lái)，通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，信號(hào)泄漏問(wèn)題已經(jīng)被解決。但是，DNA 酶?jìng)鞲衅鲄s無(wú)法被激活。

于是，他們進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，通過(guò)縮短結(jié)合臂的長(zhǎng)度，最后成功構(gòu)建了 DNAzyme 傳感器。

通過(guò)此，他們構(gòu)造了一個(gè)單鏈、自鎖定的單分子系統(tǒng)，并將這種傳感系統(tǒng)命名為 SPOT（用于核酸檢測(cè)的靈敏的環(huán)啟動(dòng) DNAzyme 生物傳感器）。

同時(shí)，他們進(jìn)一步將 SPOT 與試紙條結(jié)合，為 SPOT 實(shí)現(xiàn) POCT 檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

經(jīng)過(guò)全面優(yōu)化和 SPOT 檢測(cè)，在單管、一步、無(wú)預(yù)擴(kuò)增和等溫檢測(cè)的前提下，實(shí)現(xiàn)了對(duì) miR-21 的 15fM、對(duì)病毒 RNA 的 1.9aM 的強(qiáng)大檢測(cè)靈敏度，以及對(duì)于核酸靶標(biāo)的檢測(cè)特異性（區(qū)分變異體）。

最終，相關(guān)論文以《一種用于核酸敏感檢測(cè)的可編程 DNAzyme》（A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids）為題發(fā)在 Angewandte Chemie International Edition[1]。

史辰致是第一作者，王鵬飛擔(dān)任通訊作者。

圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：Angewandte Chemie International Edition）

不過(guò)，目前只有少量臨床樣本在 SPOT 上進(jìn)行測(cè)試。未來(lái)，課題組將對(duì)更多患者進(jìn)行臨床研究，以便全面評(píng)估 SPOT 測(cè)定的可靠性。

同時(shí)，由于本次研究采用了無(wú)前置放大器的方案，因此 SPOT 還不夠靈敏，無(wú)法在肉眼可見(jiàn)的測(cè)試條上，產(chǎn)生明顯可區(qū)分的讀數(shù)。

因此，該團(tuán)隊(duì)打算進(jìn)一步提高 SPOT 的靈敏度，或與基于等離子體/熒光的便攜式可視化設(shè)備結(jié)合，以便讓 SPOT 的 POCT 能力能被用于實(shí)際應(yīng)用。

未來(lái)，在臨床應(yīng)用層面，他們希望能夠建立多中心、大規(guī)模臨床隊(duì)列，對(duì) SPOT 體系的疾病診斷效能進(jìn)行更大范圍的論證。

在技術(shù)改進(jìn)層面，該團(tuán)隊(duì)計(jì)劃拓展 SPOT 的應(yīng)用范圍。除了核酸檢測(cè)外，他們也希望通過(guò)引入核酸適體，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)于小分子和蛋白標(biāo)志物的檢測(cè)。

參考資料：

1.Shi, C., Yang, D., Ma, X., Pan, L., Shao, Y., Arya, G., … & Wang, P. (2024). A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids. Angewandte Chemie International Edition, e202320179.

運(yùn)營(yíng)/排版：何晨龍